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PCR技术的特点介绍

2018-03-20 浏览次数:3565

1、有一定程度单核苷酸错误掺入
    TaqDNA聚合酶缺少3’-5’核酸外切酶活性,因而不能纠正反应中发生的核苷酸错误掺人;与大肠杆菌聚合酶IKlenow片段相比较,用TaqDNA聚合酶的反应错误掺人相对多些。但在PCR扩增过程中,其错配率一般只有约1/万,足可以供特异性分析。
2、操作简便、快速
    目前国内外已有多种类型的PCR扩增仪,只需把反应材料按一定浓度混合,置于仪器内,反应便按所输入的程序进行。整个PCR操作过程,从标本处理、PCR扩增到产物分析,可在4h内完成全部实验。扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆,摆脱繁琐的基因分析方法;可直接从总RNA或DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因,省去须先进行克隆后再作序列分析的模式。已固定和包埋的组织或切片亦可用于检测。
3、对起始材料质量要求低
    PCR技术对扩增样品的要求不高,仅含极微量目的DNA(pg、ng)、DNA粗制样品或者总RNA,都可用做起始材料来获得较多的目的产物。扩增样品既可以是纯化的,也可以是粗制的;既可以是新鲜组织,也可以是陈旧样品;既可以是细胞,也可以是体液;既可以是完整的大分子,也可以是部分降解的DNA。
4、可扩增RNA或cDNA
    先按通常方法用寡脱氧核苷酸引物和反转录酶将mRNA转录成主链cDNA,再将得到的单链cDNA进行PCR扩增。即使mRNA转录片段只有cDNA中的0.01%,也能经PCR扩增出10倍242bp对长度的特异性片段。有些外显子分散在一段很长的DNA中,难于将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作为模板,则可将外显子集中,用PCRl次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。
5、特异性强
    自从提取出耐热TaqDNA聚合酶以来,在热变性处理时不被消化、不必在每次循环扩增中再加入新酶,以及在较高温度下连续反应,显著提高了PCR反应产物的特异性。PCR扩增的特异性还依赖于两个引物设计的好坏,依赖于引物与模板结合的正确性。PCR反应时退火温度对特异性也有影响,一般来说,退火温度越高,扩增的特异性越好。高温启动法也可增加PCR扩增的特异性,即通过在高温(70℃)下加入某些必需因子(DNA聚合酶、模板DNA、Mg2+或引物等),使TaqDNA聚合酶仅在反应达到较高温度(>70℃)时才发挥作用。其他因素如酶浓度、dNTP、Mg2+、pH值等对PCR的特异性也有一定的影响。
6、敏感性高
    PCR产物的生成以指数方式增加,能将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA,它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。

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